¿Qué es y cómo funciona el fotocolorímetro y el espectrofotómetro?

2. Curva de calibración

Es un método utilizado para determinar la concentración de una muestra problema. Para llevarlo a cabo es necesario preparar varias soluciones patrón de concentración conocida y medir su absorbancia.

Primeramente se debe seleccionar el rango de las concentraciones de trabajo (intervalo óptimo de trabajo) tomando en cuenta la probable concentración de la muestra problema. Es conveniente que la concentración de la solución de la muestra problema se encuentre centrada en el rango de la curva de calibración y además trabajar con soluciones cuyas concentraciones se encuentren dentro del rango de linealidad de la curva.
Preparar una solución patrón (stock) de concentración conocida que contenga la misma especie absorbente que el analito.
En algunas ocasiones la muestra que se desea determinar no posee color por sí misma, en tal caso, es preciso llevar a cabo un desarrollo de color empleado reactivos que den lugar a sustancias coloreadas con la muestra que interesa estudiar, como se observa en las siguientes imágenes.

Dos ejemplos de desarrollo de color

Preparar por dilución de la solución stock al menos cinco soluciones patrón en el intervalo óptimo de trabajo.
Usar para el ensayo en blanco agua destilada, el solvente empleado o el reactivo que provocará la formación de un producto coloreado al reaccionar con la solución.
Medir la absorbancia de cada una de las soluciones patrón a la longitud de onda de máxima absorción o con el filtro adecuado. Recordar hacer la corrección con el blanco.
Registrar los datos obtenidos.

Recordar que las soluciones deben ser límpidas y presentar un color estable. La presencia de material en suspensión en una muestra produce el efecto de difusión de la radiación. La radiación difundida es radiación incidente que no se transmite y en consecuencia al ser computada como radiación absorbida se comete un error en el valor de la absorbancia.

En resumen

Construir la curva de calibración A = f [C(mol/L)] empleando un programa para construir gráficas como por ejemplo Excel, Hojas de cálculo de Open Office, Hojas de cálculo de Google Drive, u otro similar. Hallar la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación R².

El coeficiente de regresión lineal (R²) debe ser lo más próximo a uno.

La recta obtenida de la gráfica anterior, representa la relación matemática entre el valor de la señal espectrofotométrica y la concentración, cuánto mayor es la concentración del analito mayor será su absorbancia.

A través de la curva de calibración, conociendo el valor de absorbancia de la muestra problema, se puede calcular el valor de concentración del analito (véase el procedimiento explicado en siguiente enlace).